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关于固相多肽合成这些雷你都避开了吗?

发布时间:2023-08-14 浏览量:0
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什么是固相多肽合成?


拿着这个问题问问生科和化学的学生们,哪怕自己没有操作过,很多人也能回答得差不多。毕竟固相多肽合成的出现,极大地催生了相关学科的发展。


现在,一说合成多肽,第一反应就是用固相多肽合成技术,产率佳,纯度高,质量稳定,对环境友好……这个技术的优势简直太多了!


也正是因为固相多肽合成如此“好用”,自1920年多肽药物胰岛素问世以来,多肽药物就重塑了在现代制药领域的地位。在过去的20多年里,全球将近有近超过60种多肽类药物获得批准。根据一项全球多肽行业的数据分析,2016年至2024年多肽治疗的年增长率将达到9.1%。多肽行业的发展,除了固相多肽合成技术的进步之外,现实的需求也很强劲,比如代谢疾病和癌症发病率持续增加,需要更多多肽药物来进行治疗。当然,需求大,自然来钱多,最畅销的治疗代谢性疾病的多肽类药物,例如利拉鲁肽(Victoza)和类胰高血糖素肽1(GLP-1)每年至少有20亿美元的销售额[1]

咱们今天就来聊聊多肽药物制备的那些事儿。


多肽药物制备二三事

多肽泛指2~100个氨基酸经肽键连接形成的化合物,多肽药物具有生物活性高,特异性强,副作用小等特点。

从合成角度看,多肽药物的制备主要有化学合成、基因重组及天然提取三种方法,其中固相化学合成多肽技术拥有产率佳,纯度高,质量稳定,环境友好等优势,被广泛应用于3~50个序列的多肽原料药生产。

那么厉害的固相多肽合成,了解一下
多肽的化学合成主要通过以下三种反应:
(1) 有保护基氨基酸的脱保护反应;
(2) 羧基脱保护和氨基酸活化的并行反应-生成加入肽链的下一氨基酸;
(3) 偶联反应-形成酰胺键并合成最终的多肽。
在反应(1)中,原料是有保护基的氨基酸;在反应(2)中,需要多种试剂活化氨基酸的羧基。

图1. 固相多肽合成 


 

 

无论什么反应,起始原料的纯度都至关重要。在多肽固相合成中,原料Fmoc-氨基酸中的杂质主要源于Fmoc基团结合到氨基酸过程中的副反应,有以下三类:


二肽杂质
这类杂质源于在氨基酸上接入Fmoc基团的试剂和已经成形的Fmoc-氨基酸发生副反应。二肽杂质存在会导致目标氨基酸重复插接。

图2 二肽杂质

β-丙氨酰类杂质
在氨基酸中引入Fmoc基团时,Fmoc-OSu会发生开环和重排,形成β-丙氨酰类杂质。此类杂质存在会导致另一分子的的β-丙氨酸残基(B)或β-丙氨酸(A)取代目标氨基酸插接到肽段

图3 β-丙氨酰类杂质

游离氨基酸杂质
游离氨基酸源于氨基酸与Fmoc试剂的不完全反应。游离氨基酸存在会导致多个目标氨基酸重复插接肽链,导致Fmoc基团在Fmoc-氨基酸衍生物储存过程中自动催化裂解。

毫无疑问,这些杂质都会大大降低固相多肽合成的产率和纯度,增大提纯难度。

多肽合成中的“隐藏杀手”:乙酸
相比于氨基酸骨架的杂质,乙酸则更像是固相多肽合成的“天敌”。由于分子量小且也会被活化剂活化,具有高反应活性,即便痕量乙酸也会在固相合成过程中截断延伸的肽链。

有很多人觉得一点点乙酸,无关紧要。那咱们来做个数学题:


Fmoc-Arg(Pbf)-OH受到低至0.1%的乙酸污染,就相当于1mol%的乙酸污染。但如果考虑到通常试剂用量会超出5倍,而高反应活性乙酸会先于氨基酸与肽段结合,则每次循环会造成高达5%的链终止。如果合成的多肽含有3%的精氨酸残基,则意味着15%的链会终止。

图4 乙酸对合成多肽的影响

下图是实例展示。仅仅0.1%的乙酸污染对于21 mer多肽合成的影响;截断的副产物采用“*”表示。

图5 含有乙酸合成多肽的HPLC谱图

Fmoc-氨基酸中的乙酸很难检测,默克专门开发了标准Fmoc-氨基酸中乙酸定量的方法。

跟所有工业产品一样,氨基酸原料的纯度也存在批次差异。这里有个规律,纯度越高,差异性就越小。


多肽批次间差异


谈完原料,可以说说多肽了。


序列相同的多肽,不同批次间存在差异,这个无法避免。序列不同的多肽,本身的性质也有差异,比如聚集 – 疏水性多肽的浓度越高,聚集也越高,活性主要取决于聚集形态下的活性。


此外,稳定性也很重要。多肽在储存过程中会有化学转变。比如含有Asp-Gly的多肽导致形成iso-Asp,多肽中的Cys通过形成二硫键而交联以及Met氧化成亚砜和焦谷氨酸形成。这些杂质有可能带有细胞毒性,比如二硫苏糖醇(DTT)。


除了纯度之外,多肽的稳定性跟储存有关,冻干状态常比溶液更稳定;再一个影响稳定性的因素就是氨基酸组成和序列,所谓sequence depends!


下面是几个典型的组成和序列导致的稳定性降低。

水解:含Asp (D)的多肽的常见问题。含有Asp-Pro (D-P)或Asp-Gly (D-G) 组合的多肽容易脱水,形成环状亚胺中间体。另外,含有Ser (S) 的序列也可能形成可切割肽链的环状亚胺中间体。


氧化:Cys (C)和Met (M)残基是发生可逆氧化的主要氨基酸。甲硫氨酸残基发生氧化后形成甲硫氨酸亚砜和/或甲硫氨酸砜,很难逆转。


二酮哌嗪和焦谷氨酸形成:二酮哌嗪形成通常发生在甘氨酸(G)位于N末端第3位点时,Pro (P)或Gly (G)位于第1或第2位点时更易发生。如果Gln (Q)位于序列的N末端位点,则焦谷氨酸形成几乎是不可避免的。这种转变也可能发生在N末端位点含有Asn (N)的多肽序列中,但可能性较小。


归根到底,想要高质量的多肽产品,就一定需要高品质的原料和试剂。



END




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